細胞凋亡與壞死是兩種*不同的細胞凋亡形式,根據(jù)死亡細胞在形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)上的差別,可以將二者區(qū)別開來。細胞凋亡的檢測方法有很多,下面介紹幾種常用的測定方法。
根據(jù)凋亡細胞固有的形態(tài)特征,人們已經(jīng)設(shè)計了許多不同的細胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法。
1光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡
?。?)未染色細胞:凋亡細胞的體積變小、變形,細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象,細胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。
(2)染色細胞:常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化,核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。
2熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡
一般以細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來評判細胞凋亡的進展情況。
常用的DNA特異性染料有:HO33342(Hoechst33342),HO33258(Hoechst33258),DAPI。三種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的,主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍色熒光。
Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料,儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,使用時用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。
DAPI為半通透性,用于常規(guī)固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,使用終濃度一般為0.5~1mg/ml。
結(jié)果評判:細胞凋亡過程中細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期:Ⅰ期的細胞核呈波紋狀(rippled)或呈折縫樣(creased),部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài);Ⅱa期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化;Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊,產(chǎn)生凋亡小體。