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細(xì)菌中蛋白質(zhì)的提取與純化技術(shù)

更新時(shí)間:2016-04-19點(diǎn)擊次數(shù):1469

實(shí)驗(yàn)試劑

采用T7• Tag Affinity Purification Kit
T7•Tag抗體瓊脂。B/W緩沖液:4.29mM Na2HPO4,1.47 mM KH2PO4,2.7 mM KCl, 0.137mM NaCl,1%吐溫-20,pH7.3 洗脫緩沖液: 0.1M檸檬酸,pH2.2. 中和緩沖液:2M Tris,pH10.4。 PEG 20000。
實(shí)驗(yàn)步驟

1.100ml 含重組表達(dá)質(zhì)粒的菌體誘導(dǎo)后,離心5000g×5min,棄上清,收獲菌體,用10ml預(yù)冷的B/W緩沖液重懸。
2. 重懸液于冰上超聲處理,直至樣品不再粘稠,4℃離心 14000g×30min,取上清液,0.45μm膜抽濾后作為樣品液。
3. 將結(jié)合T7•Tag抗體的瓊脂充分懸起,平衡至室溫,裝入層析柱中。
4. B/W緩沖液平衡后樣品液過(guò)柱。
5. 10ml B/W緩沖液過(guò)柱,洗去未結(jié)合蛋白。
6. 用5ml洗脫緩沖液過(guò)柱,每次1ml,洗脫液用含150μl中和緩沖液的離心管收集,混勻后置于冰上,直接SDS-PAGE分析。
7. 將洗脫下來(lái)的蛋白放入透析袋中,雙蒸水透析24hr,中間換液數(shù)次。
8. 用PEG 20000濃縮蛋白。
注意事項(xiàng)

蛋白在過(guò)層析柱前,要0.45μm膜抽濾,否則幾次純化后,柱子中會(huì)有不溶物。

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